3種檢測(cè)吡咯喹啉醌的方法比較

［摘要 ］研究和比較3種檢測(cè)吡咯喹啉醌（PQQ）的方法，確定各種方法的特點(diǎn)和適用范圍。

［關(guān)鍵詞］吡咯喹啉醌 ；檢測(cè)方法；電泳法（Native－PAGE 法）；光譜法；NBT－Gly 法。

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是20世紀(jì)70年代末發(fā)現(xiàn)的一種不同于吡啶核苷酸（NAD、NADP）和核黃素（FMN、FAD）的第三類輔酶。PQQ適合生物發(fā)酵法生產(chǎn)。為了簡(jiǎn)單快速的檢測(cè)發(fā)酵液中的PQQ，我們?cè)O(shè)計(jì)并改進(jìn)了3種檢測(cè)方法：Native－PAGE 法（Native－PAGE 法）、光譜法、和NBT-Gly法。

本文利用山梨脫氫酶與其專一性輔酶PQQ結(jié)合催化底物山梨糖的特性，設(shè)計(jì)了利用氯化硝基四氮唑藍(lán)染色體檢測(cè)Native－PAGE 法中PQQ的方法。

光譜法是以D_326nm值與D_400nm值來檢測(cè)PQQ的含量。

NBT-Gly法利用了PQQ的氧化還原特性，參照文獻(xiàn)加以改進(jìn)，引入96孔板和酶標(biāo)儀，縮小了反應(yīng)體系，增加了一次檢測(cè)的樣品數(shù)量。

1 材料與方法

1.1 材料（具體見文獻(xiàn)）

1.2 樣品制備（具體見文獻(xiàn)）

1.3 分別用活性電泳檢測(cè)法、光譜法、NBT-Gly法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)限和線性范圍

利用PQQ標(biāo)準(zhǔn)品確定了3種方法的PQQ檢測(cè)限，活性電泳檢測(cè)可檢測(cè)出12.6ng/ml以上的PQQ含量；光譜法檢測(cè)，當(dāng)△D_326nm-400nm為0-0.7時(shí)，PQQ濃度與吸光度之間的線性關(guān)系良好，線性范圍為2.46-26.27μg /ml。NBT-Gly法的線性范圍為44.250ng/ml-1.416μg /ml，由于還原型NBT的不溶解性，高濃度時(shí)呈絮狀，導(dǎo)致吸光度值下降。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

考察了光譜法和NBT-Gly法的組內(nèi)精密度和組間精密度。在各方法的線性范圍內(nèi)選擇5個(gè)PQQ濃度，n=3。其具體數(shù)值見表1

2.3 樣品檢測(cè)和加樣回收率

采用Native－PAGE 法檢測(cè)供試樣品時(shí)，在同一塊聚丙烯凝膠上與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品相比，3個(gè)樣品的PQQ含量大量為6.25-12.5μg /ml.用NBT-Gly法和光譜法檢測(cè)樣品PQQ含量時(shí)，在相同條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過回歸方程計(jì)算得到樣品的PQQ含量（表2、3）。在供試品中加入標(biāo)準(zhǔn)品，考察加樣回收率（n=3）（表2、3）。進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，光譜法必須扣除培養(yǎng)基背景干擾，而其它兩法可忽略。

3  討論

Native－PAGE 法 PQQ 檢測(cè)下限為 12.6 ng / m L，靈敏度高，而且利用了 SDH 與輔酶和底物相互作用的特異性，抗干擾性強(qiáng)，適于培養(yǎng)上清等復(fù)雜樣品的粗略定量。 但該法不能用于 PQQ 的準(zhǔn)確定量，因而未考察其精密度和加樣回收率。

光譜法在 PQQ 濃度為 26.27 μg /m L～2.46 μg /m L 時(shí)與吸光度值呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，精密度好。進(jìn)行發(fā)酵樣品上清中 PQQ 含量檢測(cè)時(shí)，可將樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使 PQQ 含量落在光譜法的線性范圍內(nèi)。

NBT－Gly 法線性關(guān)系較好，在 1.416 μg / m L～44.250 ng / m L 時(shí)呈線性關(guān)系 ， 但重復(fù)性不佳 ，RSD偏高，加樣回收率為 99．64％～119．68％。 NBT－Gly 法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，一次可檢測(cè)多個(gè)樣品。

由于Native－PAGE 法檢測(cè)的靈敏度很高，在篩選 PQQ 產(chǎn)生菌時(shí)，可先進(jìn)行Native－PAGE 法檢測(cè)，確定是否含有PQQ，后用光譜法和 NBT－Gly 法進(jìn)行定量。 NBT－Gly 法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)量大，有利于從大量樣品中篩選高產(chǎn)菌株。光譜法精密度高，但在檢測(cè)樣品時(shí)會(huì)受到培養(yǎng)基的干擾，將 PQQ 純化后用此方法檢測(cè)可得到精確的 PQQ 濃度。

本文為PQQ檢測(cè)提供了3種簡(jiǎn)便易行的方法，不需要昂貴的儀器，操作過程簡(jiǎn)單，可根據(jù)實(shí)際需要選用。

文獻(xiàn)

[1] 楊延新，熊向華，游松，張惟材.3種檢測(cè)吡咯喹啉醌的方法比較[J].生物技術(shù)通訊2011，22（22）：544-547